激光共聚焦顯微鏡樣品制備的注意事項(xiàng)主要包括以下幾個(gè)方面:
一、樣品選擇與準(zhǔn)備
樣品類(lèi)型:樣品可以是固定的或活的組織,也可以是固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于懸浮細(xì)胞或懸浮粒子,應(yīng)使用共聚焦顯微鏡專(zhuān)用的培養(yǎng)皿承載樣品進(jìn)行觀察。
樣品厚度:樣品的厚度應(yīng)適中,一般為1~2mm,以便于激光穿透和成像。
二、載玻片與蓋玻片的選擇與處理
質(zhì)量選擇:載玻片和蓋玻片應(yīng)選擇質(zhì)量好、光潔、無(wú)雜質(zhì)的。重要實(shí)驗(yàn)需提前檢查其光學(xué)特性,確保無(wú)熒光干擾。
厚度要求:蓋玻片的厚度應(yīng)小于0.17mm,載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間。這樣的厚度配置有助于獲得清晰的成像效果。
處理步驟:蓋玻片使用前需用玻璃洗液浸泡處理一天以上,鉻酸浸泡過(guò)夜,去離子水沖洗掉殘存的洗液后,再用無(wú)水乙醇浸泡待用。臨用前需在酒精燈上過(guò)火滅菌處理。
三、熒光染料的選擇與標(biāo)記
染料選擇:由于激光共聚焦顯微鏡使用單一波長(zhǎng)的激光作為光源,因此熒光染料的選擇應(yīng)根據(jù)激光器的波長(zhǎng)來(lái)確定。如果在同一樣品中有多種熒光染料標(biāo)記,應(yīng)確保它們的發(fā)射波長(zhǎng)不重疊,以避免串色問(wèn)題。
標(biāo)記方法:樣品需經(jīng)熒光探針標(biāo)記(可單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)),標(biāo)記方法應(yīng)確保染料與樣品充分結(jié)合且不影響樣品的生理狀態(tài)。
四、樣品的固定與封片
固定方法:對(duì)于需要固定的樣品(如組織切片),應(yīng)采用適當(dāng)?shù)墓潭▌┻M(jìn)行處理,以確保樣品形態(tài)的穩(wěn)定性和染色的均勻性。
封片處理:如果樣品只需觀察一次且不易淬滅熒光,可使用一定濃度的甘油混合物封膜。如果樣品需要放置一段時(shí)間并多次拍攝,應(yīng)使用抗熒光淬滅的封片劑以減少熒光信號(hào)的損失。固定樣品常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
五、其他注意事項(xiàng)
操作規(guī)范:在制備樣品過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,避免污染和損壞樣品。
安全防護(hù):激光共聚焦顯微鏡中的激光發(fā)射管使用壽命有限且價(jià)格昂貴,因此在操作過(guò)程中應(yīng)注意保護(hù)激光管免受損壞。同時(shí)應(yīng)避免暴露在中等功率和高功率的激光輻射中,特別是不要注視激光束。
儀器管理:激光共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器,其正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開(kāi)科學(xué)的日常管理。應(yīng)指定儀器負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)儀器的開(kāi)關(guān)機(jī)、日常維護(hù)和狀態(tài)檢查等工作。
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡樣品制備涉及多個(gè)方面的注意事項(xiàng),包括樣品選擇與準(zhǔn)備、載玻片與蓋玻片的選擇與處理、熒光染料的選擇與標(biāo)記、樣品的固定與封片以及操作規(guī)范和安全防護(hù)等。只有嚴(yán)格遵守這些注意事項(xiàng)才能確保獲得高質(zhì)量的成像結(jié)果并保護(hù)儀器免受損壞。